La cloroquina 130

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La cloroquina inhibe la producción de TNF, IL-1 e IL-6 a partir de monocitos humanos estimulada por lipopolisacárido / macrófagos por diferentes modos de C.-H. Jang. J H. Choi. SRA. Byun y el Sr. D.-M. Jue Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica de Corea, Seúl, Corea del Sur. Correspondencia a: Sr. D.-M. Jue, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad Católica de Corea, 505 Banpo-dong, Seocho-gu, Seúl 137-701, Corea del Sur. E-mail: catholic. ac. kr dmjue Recibido el 29 de agosto de 2005. Revisión recibió 29 de noviembre de 2005. Resumen Objetivos. TNF, IL-1 e IL-6 se sabe que tienen papeles principales en la patogénesis de la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias. La cloroquina fármaco antirreumático se ha demostrado que inhiben TNF, IL-1 e IL-6, la producción de los fagocitos mononucleares. Se examinaron los mecanismos subyacentes implicados en la inhibición inducida por cloroquina de la producción de citoquinas. Métodos. células mononucleares de sangre periférica humana y monocitos / macrófagos y monocítica U-937 y las células THP-1 se estimularon con lipopolisacárido, y TNF, IL-1 e IL-6, la producción se midió por ELISA. Los niveles de mRNA fueron medidos por el norte de borrones y revertir transcriptionpolymerase reacción en cadena. Síntesis de precursor de 26 kDa TNF se midió mediante el etiquetado metabólico y análisis de inmunoprecipitación. tasa de transcripción se determinó mediante el ensayo de marcha en inercia nuclear. Resultados. la liberación de TNF de las células fue inhibida por la cloroquina, mientras que el nivel de estado estacionario de TNF-mRNA y síntesis de 26-kDa TNF precursor no se cambió por la cloroquina. En contraste, la inhibición cloroquina inducida de IL-1 e IL-6 liberación fue acompañado por una disminución en sus niveles de mRNA en estado estacionario. Las tasas de transcripción de los genes IL-1 e IL-6 no se modificaron por la cloroquina, mientras que la estabilidad de IL-1 e IL-6 mRNA se redujo por la cloroquina. aminas débiles de base tales como metilamina y cloruro de amonio no tuvieron efecto sobre la producción de TNF, mientras que bloquean parcialmente la producción de IL-1 e IL-6. Conclusiones. Nuestros resultados indican que la inhibición de la cloroquina mediada por TNF, IL-1 y la síntesis de IL-6 se produce a través de los diferentes modos en monocitos humanos estimulada por lipopolisacárido / macrófagos: bloquea la conversión de precursor de TNF asociado a células para madurar proteína soluble, mientras que reduce los niveles de IL-1 e IL-6 mRNA, al menos en parte, por la disminución de su estabilidad y por un mecanismo dependiente del pH. Palabras clave producción de citoquinas proinflamatorias tales como TNF, IL-1 e IL-6 prolongada ha sido demostrado que desempeñan un papel fundamental en la activación de células sinoviales y la destrucción articular en la artritis reumatoide (RA) 1. 2. TNF producida principalmente por monocitos y macrófagos ejerce diversos efectos en patogénesis de la AR mediante la estimulación de otras células y la inducción de daño en el tejido 3. En células estimuladas, TNF se sintetiza como un precursor de 26 kDa asociada a la membrana que es luego escindido proteolíticamente para liberar soluble, madurar proteína 17-kDa en el medio 4. 5. IL-1 producida principalmente por monocitos y macrófagos en el tejido sinovial de pacientes con AR ha sido fuertemente implicado en el daño de la articulación 6. IL-6 es una citocina pleiotrópica producida por células T, macrófagos y fibroblastos sinoviales en tejidos de las articulaciones inflamatorias 7. IL-6 se ha conocido para promover la sinovitis mediante la estimulación de la producción de anticuerpos, como resultado de su efecto sobre la maduración de las células B, y también mediante la activación de las células T, y la inducción de la proliferación de fibroblastos sinoviales 8. La administración de agentes bloqueantes de acciones de estas citocinas dio lugar a la remisión drástica de los síntomas de artritis y la reducción en los marcadores de inflamación en pacientes con AR de larga data 912. medicamentos contra la malaria, como la cloroquina e hidroxicloroquina son ampliamente utilizados en el tratamiento de la AR, ya que están relativamente bien tolerados en comparación con otros agentes anti-reumáticos de potencia similar 13. 14. La cloroquina se demostró para bloquear el TNF y la síntesis de IL-6 en el lipopolisacárido (LPS) macrófagos de ratón estimuladas y monocitos humanos 1517, aunque el modo de inhibidor observado era diferente entre el ratón y las células humanas. En nuestro estudio anterior con células RAW 264.7 de macrófago de ratón, la cloroquina ha demostrado inhibir la síntesis de TNF-principalmente mediante el bloqueo de la conversión de un precursor de 26 kDa TNF asociada a las células a la forma madura soluble de 17 kDa, en lugar de mediante la inhibición de la inducción de TNF - ARNm o síntesis de 26-kDa TNF precursor 18. Sin embargo, otros estudios con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mostraron que la cloroquina reduce la expresión inducida por LPS de TNF, IL-1 e IL-6 mRNA, y TNF asociada a las células 19. 20. La cloroquina ha demostrado inhibir la activación inducida por LPS de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2 en PBMCs humanos y la expresión del promotor impulsado por TNF-gen informador en células humanas monocíticas THP-1, lo que sugiere que bloquea la transcripción del cloroquina el gen TNF al interferir en la activación inducida por LPS de la ERK1 / 2 vía de señalización 21. La disminución cloroquina inducida por IL-1 e IL-6 mRNA no se ha estudiado en detalle, y el mecanismo subyacente es desconocido. Aquí se estudió el efecto de la cloroquina sobre la síntesis de TNF, IL-1 e IL-6 en las PBMC humanas estimuladas con LPS y los monocitos / macrófagos, y también en células monocíticas THP-1 y T-937. Nuestros resultados muestran que la cloroquina inhibe TNF liberación, pero no cambia el nivel de TNF-ARNm o la síntesis del precursor de 26 kDa TNF. También se observó que la cloroquina inhibe la IL-1 e IL-6, la producción por la disminución de sus niveles de mRNA, que a su vez está causada por una disminución en la estabilidad del mRNA en lugar de un cambio en la actividad transcripcional. Materiales y métodos Materiales La cloroquina (sal difosfato), acetato de forbol miristato (PMA), cloruro de amonio, metilamina, leupeptina y LPS (Escherichia coli 0127: B8) fueron adquiridos de Sigma Chemical (St Louis, MO, EE. UU.). sulfato de hidroxicloroquina (pureza 99,3 IntaPort Company, Ridgewood, Nueva Jersey, EE. UU.) fue un regalo de Yuhan Industrial (Seúl, Corea). Ratón y monoclonales de rata anticuerpos para el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de TNF humano y la IL-6, isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con anti-TNF y anti IL-6-anticuerpos, ficoeritrina (PE) itrio anticuerpo para CD14 se compraron de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA, EE. UU.). Los anticuerpos monoclonales para ELISA de IL-1 humana y la IL-1 humana recombinante y la IL-6 se obtuvieron de Pierce Biotechnology (Rockford, IL, EE. UU.). TNF humana recombinante fue preparado por la expresión en E. coli como se ha descrito previamente 22. Los antisueros policlonales a TNF humano se prepararon mediante la inmunización de conejos con la proteína recombinante purificada. Cultivo de células concentrado leucocitario humano se obtuvo de la Cruz Roja de Corea del Banco de Sangre (Seúl, Corea). Cada concentrado de leucocitos se preparó a partir de la sangre de un solo donante. PBMCs, se prepararon a partir del concentrado de leucocitos por centrifugación en gradiente de densidad Ficollhypaque y monocitos / macrófagos se aislaron de PBMC, por adherencia a placas de cultivo de Dulbecco libre de suero modificado Eagles medio 23. Las células adherentes se recuperaron mediante raspado y se resuspendieron en RPMI 1640 que contiene 10 suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.). leucemia monocítica células humanas THP-1 y linfoma histiocítico células U-937 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.) y se mantuvieron en RPMI 1640 que contiene 10 FBS. THP-1 y las células U-937 se incubaron con PMA (20 ng / ml) durante 48 h para inducir la diferenciación de los monocitos / macrófagos antes de la estimulación LPS 24. Las células se incubaron con cloroquina durante 2 h antes de la estimulación con LPS (1 g / ml). La viabilidad celular se midió por tinción de las células con bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio 25. ELISA de TNF, IL-1 e IL-6 en el sobrenadante del cultivo y el lisado celular se midieron por ELISA sándwich, utilizando anticuerpos monoclonales específicos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para determinar el nivel de citoquinas asociadas a células, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en un tampón que contiene 0,5 NP-40 23. proteínas recombinantes estándar también se diluyeron en PBS que contenía las mismas concentraciones de NP-40 como el lisado de células. Las cantidades de citoquinas en el sobrenadante del cultivo y el lisado de células se presentan como los producidos a partir de 1 10 6 células. Análisis de ARNm de ARNm de TNF, IL-1 e IL-6 se midió por análisis de transferencia Northern o después de RNA total se había aislado a partir de células utilizando un kit de aislamiento de ARN reacción en cadena transcriptionpolymerase (RT-PCR) (RNA-Stat-60 Tel-test, Friendswood, TX, EE. UU.). Para medir ARNm mediante análisis Northern blot, las muestras de ARN (1,015 g) se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1, se transfirieron a membrana de nylon, y se hibridaron con cDNA marcado con digoxigenina sondas 18. Las transferencias se visualizaron mediante el uso de anticuerpo anti-digoxigenina y de detección de quimioluminiscencia (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Las sondas fueron preparadas mediante amplificación por PCR del ADNc respectivo con digoxigenina-11-dUTP. clones de cDNA de TNF humano y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se prepararon como se ha descrito previamente 22. 23. ADNc de IL-1 e IL-6 fueron generados por RT-PCR con los conjuntos de cebadores específicos y ARN molde obtenidos a partir de células U-937 y PMA-e ionomicina estimulada por células T humanas, respectivamente. ADNc amplificados por PCR fueron clonados en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, EE. UU.). Los cebadores para la IL-1 de ADNc se AGCCATGGCAGAAGTACCT y CAGCTCTCTTTAGGAAGACAC los de IL-6 de cDNA se ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC y GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG. Para medir ARNm por RT-PCR, cDNA se sintetizó usando Moloney virus de leucemia murina de la transcriptasa inversa (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de PCR usados ​​fueron como se ha descrito anteriormente para actina, IL-1 e IL-6 26. Los cebadores para TNF ADNc se TCTCGAACCCCGAGTGACAA y TGAAGAGGACCTGGGAGTAG. La amplificación por PCR consistió en 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 s, hibridación a 55ºC durante 30 s y extensión a 72ºC durante 1 min. Todos los PCR se realizaron en diversas cantidades de números de ADNc y de ciclo para asegurar que los productos medidos estaban en el intervalo lineal. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 1,5 y se tiñeron con bromuro de etidio, y la intensidad de las bandas se midió en un sistema de vídeo aún (Eagle Eye II Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.). La citometría de flujo PBMCs tratados con fueron cosechadas diversos agentes, se incubaron durante 20 min en PBS que contenía suero humano normal 10 y 0,1 NaN 3. y se lavaron en PBS que contenía FBS al 1 y 0,1 NaN3 (tampón de tinción). CD14 en la superficie de monocitos / macrófagos se tiñó con un anticuerpo monoclonal conjugado con PE para 30 min. Las células se lavaron en tampón de tinción, se resuspendieron en tampón de fijación / permeabilización (Cytofix / Cytoperm BD Pharmingen), y se incubaron durante 20 min. Las células se tiñeron con FITC marcado anticuerpos monoclonales anti-IL-6 en hielo durante 30 minutos, se lavaron con tampón de tinción anti-TNF o, y se analizaron con un citómetro de flujo (FACSorter Becton Dickinson, Mountain View, CA, EE. UU.). células metabólicas de etiquetado y de inmunoprecipitación THP-1 cultivadas en una placa de seis pocillos (5 10 5 células / ml) se incubaron con PMA durante 48 h y se estimularon con LPS durante 2 h en ausencia o presencia de cloroquina. Las células se incubaron durante 30 minutos en metionina / medio RPMI 1640 cisteína-deficiente (ICN, Irvine, CA, EE. UU.) y se marcaron durante otros 30 minutos mediante la adición de 35 Smethionine mezcla / cisteína (NEN, Boston, MA, EE. UU.) (100 Ci /bien). LPS y cloroquina se añadieron al medio de inanición y etiquetado si es necesario. El análisis de inmunoprecipitación de precursor de TNF en el lisado celular fue realizado con el anticuerpo TNF anti-humano policlonal como se describió anteriormente 18. Después de la separación de complejos inmunes por electroforesis en gel de dodecil sulphatepolyacrylamide de sodio (SDS-PAGE), el gel se fijó en 10 ácido acético / 30 metanol, empapado en una solución de líquido de centelleo (22 de 2,5-difeniloxazol en ácido acético) durante 1 h, se secó, y se expusieron a película de rayos X a 70ºC. carrera en Nuclear ensayo se realizó el ensayo de marcha en inercia nuclear como se ha descrito previamente 27 con algunas modificaciones. núcleos aislados a partir de monocitos / macrófagos (1 10 7 células) se incubaron en presencia de - 32 PUTP, ATP, CTP y GTP a 37ºC durante 30 min. La transcripción sintetizado se aisló utilizando RNA-Stat-60 y se hibridó a la membrana de nylon (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) con los puntos inmovilizados que contienen 5 g de TNF-linealizado, IL-1, IL-6 y de ADNc clonados en pGEM-actina vectores T. La hibridación se llevó a cabo a 50ºC durante 3 días y transferencias se lavaron dos veces en 2 citrato de solución salina estándar (SSC), 0,1 SDS a 65ºC durante 30 min, una vez en 2 SSC, RNasa A (10 g / ml) a 37ºC durante 60 min , y dos veces en 0,5 SSC, SDS 0,1 a 37ºC durante 30 minutos antes de la exposición a película de rayos X o una placa de fósforo de imágenes (BAS-2500, Fujifilm, Osaka, Japón). Resultados Efecto de la cloroquina sobre la síntesis de TNF Para examinar el efecto de la cloroquina sobre la síntesis de TNF, se determinó el TNF y compuestos intermedios de su síntesis en las células de la cloroquina tratada. En primer lugar, se midió TNF producción de varios tipos de células humanas, tales como PBMCs, monocitos / macrófagos y U937 diferenciadas y células THP-1. Después de la estimulación de las células con LPS, se midió TNF liberado en el medio de cultivo y la asociada a las células por ELISA (Fig. 1 A). producción de TNF fue insignificante en células no estimuladas, mientras que la adición de LPS indujo un notable aumento de su nivel. La incubación de las células con cloroquina dio como resultado una supresión dependiente de la dosis de la producción de TNF, que resulta en 90 después de la incubación con 100 m de cloroquina (datos no mostrados). Medición de TNF en el lisado celular reveló que la cloroquina no cambió, o aumentó ligeramente, asociado a células TNF en PBMCs, monocitos (no evidente en la Fig. 1 A causa de la alta nivel de TNF en el medio), U937 y THP-1 células (Fig. 1 A). A continuación, analizó TNF mRNA mediante transferencia northern en las mismas células para probar si la inhibición de la producción de TNF por la cloroquina fue causada por una disminución de su mRNA (Fig. 1 B). En contraste con su efecto inhibidor sobre la producción de TNF, el nivel de estado estacionario de TNF mRNA no se redujo significativamente por la cloroquina. La inhibición de la síntesis de TNF por la cloroquina en ausencia de disminución concomitante de TNF-mRNA. (A) PBMC humano, monocitos / macrófagos, células U937 y THP-1 se incubaron con o sin diversas dosis de cloroquina durante 2 h. Después de la adición de LPS (1 g / ml), PBMC y los monocitos / macrófagos se incubaron durante 12 h, y las células U937 y THP-1 para 6 h. TNF en el medio de cultivo y células lisado se midió por ELISA. (B) el ARN celular total se preparó a partir de células incubadas como en (A) después de 4 h de inducción LPS. análisis de transferencia Northern de mRNA de TNF y GAPDH se llevó a cabo con sondas marcadas con digoxigenina y las bandas se visualizaron por la reacción de quimioluminiscencia. Los datos representan tres experimentos independientes. Debido a que los resultados anteriores sugieren que el efecto inhibidor de la cloroquina sobre la síntesis de TNF aparece en una etapa post-transcripcional, entonces probado el efecto de la cloroquina sobre la síntesis del precursor de 26 kDa TNF asociado a células. Para confirmar los resultados obtenidos por ELISA de lisado de células, se midió TNF asociado a células en los monocitos / macrófagos mediante citometría de flujo utilizando marcado con FITC anticuerpo anti-TNF (Fig. 2 A). LPS inducido por la expresión de TNF asociado a células no se cambió por la cloroquina incluso a 100 m de la concentración, mientras que la expresión se redujo notablemente de la IL-6 hasta 25 m de cloroquina asociada a las células. A continuación, examinó el efecto de la cloroquina sobre la síntesis del precursor de TNF asociada a la membrana mediante el etiquetado metabólicamente PBMCs estimuladas con LPS 35 Smethionine / cisteína durante 30 min en ausencia o presencia de cloroquina. La cantidad de precursor de TNF sintetizado se controló por análisis de inmunoprecipitación de lisado de células con el anticuerpo anti-TNF y fluorografía. Como se muestra en la Fig. 2 B, la cantidad de radiomarcado precursor 26-kDa TNF no se redujo en las células tratadas con cloroquina en comparación con que las células en el control incubadas con LPS solo. La cloroquina no bloquea la síntesis del precursor de 26 kDa TNF. (A) La citometría de flujo análisis de TNF asociado a células y la IL-6. PBMCs se incubaron en ausencia (sombreadas) o presencia de LPS (abierto) y varias concentraciones de cloroquina. Después de 4 h, las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD14-PE, se permeabilizaron y se tiñeron con FITC conjugado con anti-TNF o anticuerpo anti-IL-6, y se analizaron por citometría de flujo. Se presenta el porcentaje de células teñidas positivamente con anti-TNF o IL-6 anticuerpo anti (región M2) entre las células CD14, y los porcentajes de células no estimuladas se dan en paréntesis. (B) PBMCs se incubaron en ausencia (carriles 1 y 6) o presencia (carriles 25) de LPS e indicaron concentraciones de cloroquina durante 2 h. Después de ser marcada con 35 Smethionine mezcla / cisteína, se lisaron las células y asociada a la membrana 26-kDa TNF precursor (maTNF) en el lisado se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-TNF. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE y se visualizaron por fluorografía. Las posiciones de los marcadores de peso molecular y precursor de TNF asociada a la membrana (maTNF) se indican. Los datos representan dos experimentos independientes. Efecto de la cloroquina sobre la síntesis de IL-1 e IL-6 Para examinar si la cloroquina inhibe la síntesis de otras citoquinas proinflamatorias de una manera similar a TNF, que mide las cantidades de IL-1 e IL-6 liberados en el medio de cultivo por ELISA y su nivel de ARNm mediante análisis de transferencia Northern después de la estimulación con LPS de las células. Como se muestra en la Fig. 3 A, el tratamiento de las PBMC y los monocitos / macrófagos con cloroquina disminuyó IL-1 e IL-6 liberación. Como se informó anteriormente 28, una gran cantidad de IL-1 (probablemente en forma de proIL-1) se retuvo en la célula, y el nivel de célula asociada a IL-1 también se redujo por la cloroquina. En contraste con su efecto sobre TNF mRNA, tratamiento con cloroquina disminución de los niveles de IL-1 e IL-6 ARNm en un intervalo de concentración que inhibe la síntesis de proteínas (Fig. 3 B). No se observaron efectos inhibidores similares de la cloroquina en sus niveles de ARNm de IL-1 y la síntesis de IL-6 y en los experimentos realizados con U937 diferenciadas y células THP-1 (datos no presentados). La cloroquina disminuye la síntesis de IL-1 e IL-6 y sus niveles de mRNA. PBMCs, y monocitos / macrófagos se incubaron como se describe en la Fig. 1. IL-1 e IL-6 en el medio de cultivo y células lisado se midieron por ELISA (A) y mRNAs se midieron mediante análisis de Northern blot (B). Los datos representan tres experimentos independientes. La cloroquina reduce la estabilidad de mRNA de IL-1 e IL-6 Se realizó carrera en el análisis nuclear para determinar si la cloroquina modula la actividad transcripcional del TNF, IL-1 y los genes en estimuladas con LPS monocitos / macrófagos (figura 6 IL-. 4 A, B). actividad transcripcional del TNF y IL-1 genes se incrementó aproximadamente 50 y 500, respectivamente, por LPS, mientras que la del gen de la IL-6 fue elevado incluso en las células no estimuladas y no se aumentó aún más por LPS. La adición de cloroquina no cambió significativamente la actividad transcripcional de estos genes de citoquinas en las células estimuladas con LPS o no estimuladas. De ahí se determinó la estabilidad de TNF, IL-1 e IL-6 ARNm en las células tratadas con cloroquina con el fin de investigar la regulación post-transcripcional de su expresión por la cloroquina. En las células THP-1 estimuladas con LPS durante 4 h, la cinética de la descomposición de TNF, IL-1 e IL-6 mRNA se analizó por RT-PCR después de tratar las células con actinomicina D para terminar la transcripción de novo (Fig. 4 C). TNF-ARNm se degrada con una vida media de alrededor de 8 h, y que no se alteró significativamente por la cloroquina. Esto está en contraste con la IL-6 mRNA, cuya vida media de alrededor de 8 h en células de control se redujo significativamente a alrededor de 4 h en las células tratadas con cloroquina. La degradación de IL-1 mRNA también se aceleró en las células incubadas con cloroquina, aunque el cambio en la tasa de degradación causada por la cloroquina fue menos notable que la de IL-6 mRNA. Efecto de la cloroquina sobre la actividad transcripcional de TNF, IL-1 e IL-6 genes y su estabilidad mRNA. (A) Los núcleos de transcripción competentes se prepararon a partir de monocitos / macrófagos estimulados con LPS (1 g / ml) durante 2 h. carrera en Nuclear análisis se realizó utilizando una sonda para TNF, IL-1, IL-6, pGEM-T vector y actina manchado sobre una membrana de nylon. (B) La radiactividad de cada punto en A se cuantificó por análisis de fósforo formador de imágenes y se normalizó con la de actina, y la actividad transcripcional de cada gen se presenta en relación con la de las células no estimuladas. Los datos representan tres experimentos independientes. (C) células THP-1 estimuladas con LPS (10 g / ml) durante 4 h en presencia (círculos cerrados) o ausencia (círculos abiertos) de 100 m cloroquina fueron tratados con actinomicina D (5 g / ml) junto con LPS y la cloroquina durante los periodos indicados. El ARN total se aisló y los niveles de ARNm se determinó mediante RT-PCR utilizando conjuntos de cebadores específicos, y se muestran después de la normalización con respecto a los de actina. Los datos de A y B representan tres experimentos independientes y los de C representan dos experimentos independientes. Efecto inhibidor de la cloroquina sobre la síntesis de IL-1 e IL-6 se produce parcialmente a través de su cloroquina propiedad débil-base, como una amina débil-base, se sabe que inhibe las funciones endolysosomal mediante la neutralización de la acidez de estos orgánulos 29. Hemos examinado si esta propiedad lysosomotropic de la cloroquina se asocia con su acción inhibitoria en TNF, IL-1 e IL-6 por la síntesis de probar el efecto de otras aminas débil-base y la leupeptina inhibidor de proteasa lisosomal en la síntesis de estas citocinas en LPS monocitos / macrófagos estimuladas (Fig. 5). Hidroxicloroquina, un congénere hidrófila de cloroquina, mostró una actividad inhibidora que era más potente que o comparable a la de la cloroquina. Por otro lado, metilamina y cloruro de amonio no tuvo ningún efecto sobre la síntesis de TNF, mientras que parcialmente bloqueados IL-1 y la síntesis de IL-6, metilamina ser el más eficaz de los dos. La leupeptina inhibidor de proteasa lisosomal, que no tiene efecto de pH de elevación, no inhibió la síntesis de estas citoquinas. Se observó una inhibición similar de la síntesis de citoquinas por los inhibidores lisosomales en los experimentos realizados con células THP-1 (datos no presentados). propiedad débil-base de la cloroquina es parcialmente responsable de la inhibición de la síntesis de IL-1 e IL-6. Los monocitos / macrófagos se trataron con cloroquina (CQ, 100 m), hidroxicloroquina (HCQ, 100 m), metilamina (MA, 10 mm), cloruro de amonio (AC, 10 mm) o leupeptina (LP, 250 m) por 2 h, y se estimularon con LPS (1 g / ml) durante 6 h. Los niveles de TNF, IL-1 e IL-6 liberados en el medio de cultivo se midieron por ELISA. significados estadística de las diferencias se determinaron utilizando Bonferronis método de comparación múltiple y los resultados se expresan como media s. re. (N 4). P 0,01 en comparación con células de control estimuladas con LPS. Los datos representan tres experimentos independientes. Discusión En este estudio, hemos demostrado que la inhibición de la síntesis de TNF por la cloroquina se produce en una etapa posterior a la traducción en lugar de un paso de la transcripción. En PBMCs humanas primarias y monocitos / macrófagos y monocitos THP-1 y células U-937 estimuladas con LPS, tratamiento con cloroquina reduce comúnmente la cantidad de TNF liberado en el medio de cultivo pero no alteró el nivel de TNF-ARNm y la transcripción la actividad del gen de TNF cuando se determina por transferencia de Northern y nuclear run-en el análisis, respectivamente (Figs 1 y 4). Además, el análisis de TNF asociada a las células por ELISA y citometría de flujo y análisis de inmunoprecipitación de TNF marcada metabólicamente indicó que el nivel o la síntesis de un precursor de 26 kDa TNF asociado a células no disminuye por cloroquina (Fig. 1 y 2) . Estos resultados estuvieron de acuerdo bien con nuestro estudio previo realizado en células RAW 264.7 de macrófago de ratón 18, y sugieren que el efecto inhibidor, que aparece después de la síntesis del precursor de 26 kDa TNF, es común entre humanos y de ratón monocitos / macrófagos. Sin embargo, nuestros resultados contradicen los de otros estudios, que mostró una disminución cloroquina inducida por TNF-mRNA en PBMCs humanos 19. 20 y la supresión de la expresión del indicador promotor impulsado por TNF en células THP-1 21. Además, la cloroquina se ha demostrado que bloquear la activación inducida por LPS de ERK proteína quinasa activada por mitógeno en PBMCs, lo que sugiere que la inhibición de la señalización de ERK mediada por LPS es responsable de la disminución de la cloroquina inducida en la actividad transcripcional del gen de TNF-21. En nuestro experimento con células THP-1, sin embargo, no se observó ningún cambio en la activación de ERK1 / 2 o MEK1 / 2, una quinasa aguas arriba de ERK, por cloroquina (resultado inédito, C. H.C. y D. M.J.). no parece que es causada por una diferencia en los tipos de células, ya que las PBMC y las células THP-1 se usan comúnmente Esta discrepancia entre nuestro resultado y otros estudios. Aunque la causa de esta discrepancia no está clara, las diferencias en la fuente de células y condiciones de cultivo pueden ser responsables de los diferentes resultados. En conjunto, nuestros resultados mostraron que el TNF mRNA no se reduce por la cloroquina o bien en las células primarias o en células monocíticas transformado. Nuestros resultados mostraron que el nivel de la membrana asociada 26-kDa TNF no se reduce por la cloroquina, y esto TNF asociada a la membrana ha demostrado ser activa en la que es capaz de lisar TNF (Fig. 2) - diana sensible 30. 31 células. la sobreexpresión de TNF excesiva asociada a la membrana en ratones por manipulación genética o mediante la administración de TNF - enzima de conversión (TACE) inhibidor de artritis inducida y exacerbación de enfermedades hepáticas inflamatorias 3234. Sin embargo, se mostró a estar completamente protegido de choque endotóxico y la encefalomielitis autoinmune experimental 35. 36 ratones manipulados para expresar TNF membrana asociada a un nivel normalmente regulada. Esta actividad subóptima de TNF asociada a la membrana en las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas podría reflejar el nivel relativamente bajo de TNF asociada a la membrana en comparación con la de secretada de 17 kDa TNF-5. En nuestra medida, el nivel de TNF asociada a las células era sólo aproximadamente 1 de la de TNF secretado en cultivos de PBMC y monocitos / macrófagos estimulados con LPS durante 6 h (Fig. 1 A y datos no presentados). La cloroquina indujo un aumento de TNF asociado a células sólo ligeramente (Fig. 2), y nuestro estudio anterior mostró que el nivel de la superficie celular de TNF en macrófagos cloroquina tratada es similar a la de células control sin tratar 18. Estos resultados sugieren que el TNF asociada a la membrana que queda en las células tratadas con cloroquina exposiciones en la mayoría de las funciones proinflamatorias de menor importancia. En contraste con los resultados obtenidos con el TNF, la inhibición de IL-1 e IL-6 por la síntesis de la cloroquina fue acompañado por disminuciones en sus niveles de mRNA. Supresión de los niveles de ARNm de IL-1 y la síntesis de IL-6 y por la cloroquina en el mismo intervalo de concentración sugiere que el cambio en el nivel de ARNm es de hecho responsable de la disminución en la producción de estas citoquinas (Fig. 3). Nuestro resultado está de acuerdo con la de un informe anterior 19, y sugiere que la cloroquina modula algún paso (s) en la síntesis y metabolismo de la IL-1 e IL-6 mRNA: transcripción de IL-1 e IL-6 genes, la procesamiento de los transcritos primarios en el núcleo, el transporte de ARNm procesado al citosol, y la degradación de mRNA. En nuestra carrera en el análisis nuclear, las actividades de transcripción de los genes IL-1 e IL-6 en los monocitos estimulados con LPS / macrófagos fueron no alteró significativamente por la cloroquina, lo que sugiere que la cloroquina no afecta a la síntesis de transcritos primarios de estas citoquinas. Por el contrario, ha demostrado ser disminuido en la cloroquina la estabilidad de IL-1 e IL-6 mRNA. Aunque es posible que la cloroquina también modula otros pasos del metabolismo del mRNA, nuestro resultado indica que la descomposición acelerada puede ser responsable, al menos en parte, por la disminución de cloroquina inducida en los niveles de IL-6 de ARNm de IL-1 y. En nuestro nuclear run-en ensayos, la tasa de transcripción del gen de IL-6 fue elevado incluso en las células que no fueron estimuladas con LPS (Fig. 4 A, B). Este aumento de la tasa de transcripción del gen de IL-6 en los monocitos / macrófagos se observó consistentemente en experimentos repetidos, y también en los experimentos realizados con U-937 y THP-1 células que fueron inducidos o no inducidas a diferenciarse en macrófagos mediante la incubación con PMA ( datos no mostrados). En estudios anteriores, los ensayos de marcha en inercia nucleares de IL-6 transcripción de genes en PBMCs y monocitos mostraron que la baja tasa basal de la transcripción se incrementó tras la estimulación LPS 37. 38. Esta discrepancia entre nuestros resultados y los de otros grupos podría indicar un problema desconocido en nuestro método de ensayo. Por el contrario, es posible que el aumento de IL-6 ARNm en los monocitos / macrófagos estimulados con LPS depende en gran medida un mecanismo de control post-transcripcional en nuestras condiciones experimentales. Nuestro experimento con inhibidores de lisosoma / endosoma apoya aún más nuestra opinión de que la acción de la cloroquina en la inhibición de la síntesis de TNF, IL-1 e IL-6 opera a través de diferentes modos. Debido a su propiedad débil-base, la cloroquina se conoce para neutralizar ácidos compartimentos celulares, incluyendo lisosomas y endosomas, y alterar la orientación y el tráfico intracelular de proteínas recién sintetizadas 29. 39. Cuando añadimos otras aminas base débil (metilamina y cloruro de amonio) al medio de cultivo de monocitos / macrófagos y células THP-1 en lugar de la cloroquina, que no observó ninguna inhibición de la producción de TNF por estos agentes. Este resultado muestra que la propiedad débil-base de cloroquina no está involucrado en la inhibición de la síntesis de TNF, y confirma los resultados de estudios anteriores llevados a cabo con células RAW 264.7 18 y PBMC humano 20. Por el contrario, nuestro resultado mostró que la producción de IL-1 e IL-6 se redujo en metilamina y cloruro de amonio, aunque en un grado menor que por la cloroquina e hidroxicloroquina. En un estudio anterior, se demostró que las aminas débil-base como la cloroquina y cloruro de amonio para interferir con la secreción de IL-1 a través de una vía que implica vesículas relacionadas con endolysosome en monocitos estimulados con LPS 40. Por lo tanto, es posible que la inhibición de la producción de IL-1 inducida por aminas débil-base se produce mediante el bloqueo de la secreción de proIL-1 en lugar de por la disminución de ARNm de IL-1. Sin embargo, nuestra medición de los niveles de IL-6 de ARNm de IL-1 y demostró que metilamina y cloruro de amonio, tales como cloroquina, induce disminuciones en los niveles de mRNA en una medida similar a la disminución de los niveles de IL-1 e IL-6 secretadas (datos no mostrados ). Estos resultados sugieren que la cloroquina y otras aminas débil-base inhiben IL-1 e IL-6 síntesis en gran medida por la disminución de sus niveles de ARNm y que un cierto paso sensible al pH está involucrada en el procesamiento y el mantenimiento de IL-1 e IL-6 mRNA .